domingo, 18 de mayo de 2008

duplicacion del ADN

Duplicación del DNA
Una de las principales características de un ser vivo su capacidad de reproducirse; es decir, la capacidad que tiene un organismo de formar otro organismo nuevo.
La célula como mínima unidad de vida tiene esta capacidad de formar células hijas (división celular), para esto necesita duplicar su estructura junto con toda la información que lleva contenida en su genoma y pasarlo a las células resultantes de esta división.
La molécula encargada de llevar toda la información que va a determinar las características de un organismo es el ADN. Entonces cuando una célula se duplica también se tiene que duplicar su ADN.
Este fenómeno de duplicación se tiene que dar por lo menos una vez durante cada división celular, digo por lo menos una vez porque ocurren casos como por ejemplo: durante el periodo de embriogénesis podemos ver fenómenos de duplicación bastante rápidos, tan rápidos, que la duplicación del ADN muchas veces le gana a la división celular, es así como podemos obtener células que a pesar de haber duplicado su DNA no se han dividido, es decir son binucleadas o multinucleadas.








Este fenómeno de la duplicación del ADN tiene que ser estrictamente controlada. Hay señales que le indican a la célula cuando duplicar su ADN y esto se da en la fase S, la fase de síntesis de ADN. El punto en el cual se determina la síntesis de ADN se da a principios de la fase S. Este punto es el punto R, en este punto ocurre la fosforilación de proteínas (activación) que van a desencadenar que la molécula de ADN realice la duplicación. Una vez iniciada la duplicación esta no puede ser detenida.

Ya conocemos el modelo estructural del ADN, es una doble hélice antiparalela cuyas bases nitrogenadas son complementarias, es decir una Adenina (A) se une con una Timina (T) mediante un doble enlace de puentes de hidrogeno y una Citocina (C) se une a Guanina (G) mediante un triple enlace de hidrogeno.











El número de puentes de hidrogeno que forma uno con otro es bastante importante para entender fenómenos de regulación de la duplicación del DNA, porque C-G tienen tres puentes de hidrógeno y A-T tiene solo dos y para duplicar la hebra de ADN hay que abrir la doble hebra a monohebra, aquellas pares de bases nitrogenadas mientras solo tengan dos puentes de hidrogeno va a ser mas fácil actuar sobre ellas, y es por eso que en el sitio de iniciación de la duplicación, de la replicación y de muchos fenómenos son ricos en A y T , como la caja TATA para la transducción.
El replicon
Para que el DNA se duplique no basta con tener la secuencia y ponerlo frente a la acción de enzimas, sino que presenta una estructura básica para replicarse, esta estructura es el replicón. El replicón es una secuencia de DNA cuya estructura garantiza la autoreplicación, fundamentalmente se compone de tres partes: un inicio que es el punto ORI; un final, el punto TER; y una parte media donde ocurre la replicación que es la horquilla de replicación.
En bacterias (procariotas) el genoma tiene un solo replicón, el cromosoma bacteriano es el único replicón, lo cual difiere del genoma de los eucariotas en el cual hay múltiples replicones. El replicón de procariontes, al ser uno solo el encargado de duplicar todo el genoma, son bastante grandes a comparación de los eucariotas que ha dividido el trabajo de duplicar su enorme ADN en muchos replicones, entonces el replicón procariota es mas grande (millones de bases, todo el genoma es un replicón) que el de los eucariota (40 kb aproximadamente).
Otra diferencia es la velocidad con la cual se duplica, el ADN procariota se duplica mucho más rápido que el DNA eucariota. Si tenemos que el replicón eucariota que se divide a 2000 pbm (pares de bases por minuto) mientras que el procariota lo hace a 50 000 pbm, la diferencia es abrumadora, 25 veces más.
Partes del replicón
El ORI, es una secuencia de pares de bases en donde se van a unir las enzimas encargadas de la replicación de ADN, es un motivo de ADN donde se pegan las enzimas, el ORI va a garantizar la replicación del ADN, es una secuencia bastante conservada de alrededor de 245 pb y existe tan solo un ORI por replicón, además el ORI garantiza la duplicación de la hebra sobre la cual se encuentra y no de la hebra complementaria, es decir que los ORI tienen que existir de a pares, uno por cada hebra complementaria.
El ORI es el punto de inicio de la duplicación pero no es el punto donde se duplica el ADN.
La horquilla de replicación, es el sitio donde se produce activamente la síntesis de ADN, es decir donde el ADN esta creciendo, esta polimerizándose.
El DNA procariota tiene una sola horquilla de replicación, mientras que la célula eucariota tiene muchas horquillas de replicación.
Habíamos dicho que la forma en la que se duplica el ADN en eucariotas es lenta, podría calcularse que el ADN completo se duplica en 1 hora, pero esto no ocurre así, sino que se duplica es 6 horas, esto quiere decir que en eucariotas las horquillas de replicación no se forman todas al mismo tiempo; entonces, si paramos una célula en un momento determinados solo el 15% de los ORIs estarán activados y las horquillas formadas no tendrán el mismo tamaño puesto que los ORIs no se encendieron al mismo tiempo, veremos unas horquillas mas grandes que otras.
El punto TER, son pequeñas secuencias de aproximadamente 10 pb a donde se van a unir otras proteínas (proteínas TER), lo que hacen estas proteínas es unirse a estos puntos TER en el ADN y estabilizar la doble hebra de tal manera que la doble hebra queda sujetada por esta proteína y la horquilla de replicación ya no puede avanzar.

Modelos de replicación
“Asa en D”
Este modelo es seguido por los DNA mitocondriales de eucariotas los cuales tienen el ORI de cada cadena parental en posiciones no confrontadas. Esto hace que una de las cadenas hijas comience y termine su replicación antes que la otra separándose de la cadena que aun se encuentra en replicación. Este fenómeno es observado microscópicamente viendo que la molécula en replicación adopta una forma de “D”.

Circulo Rodante
Se da en ciertos genomas circulares en donde se produce una mella en una de las hebras de la doble cadena parental, en donde la DNA polimerasa entra y extiende el ADN roto usando como molde la hebra intacta, a la cual le puede dar varias vueltas completas, generando un DNA lineal monocatenario multimerico. Este replica su hebra complementaria generando un dúplex durante este estado extendido, el cual posteriormente se corta y cada monómero es circularizado. Esto es común en muchos fagos.


Fusión De Replicones
En eucariotas la replicación se da en unidades independientes denominadas replicones, los cuales se unen una vez terminado el proceso de replicación.






Replicación de DNA
La Pre-Iniciacion
Las moléculas encargadas de duplicar el DNA es la enzima DNA polimerasa. Podemos presentar a la enzima como una proteína con dos regiones, entonces una región esta encargada de polimerizar ADN y otra región que esta detrás encargada de romper o eliminar DNA. Pero antes de que actúe la DNA polimerasa hay otras moléculas que también intervienen en la duplicación.
El DNA es una molécula bastante grande, es una molécula enorme y la célula no la tiene en estado laxo sino bajo la forma de una superhelice porque al ser un molécula bastante grande y en la célula es importante ahorrar espacio, lo que requiere es compactar esta molécula para que ocupe un lugar pequeño. Entonces durante el proceso de duplicación celular y especialmente durante la etapa de la preiniciación de la duplicación, el ADN suele ser transformado de un estado de superhélice a un estado hélice, lo cual va a facilitar a las enzimas en principio acceder a la doble hebra, encontrar el ORI, y por lo tanto comenzar la duplicación. Este fenómeno esta dado por dos tipos de enzimas: las topoisomerasas y las DNA girasas, cuya función es transformar el DNA de un estado de superhelice a un estado laxo de hélice.



Las topoisomerasas reconocen regiones repetitivas de DNA, por ejemplo una región repetida es el ORI, entonces las topoisomerasas reconocen el ORI desestabilizando la doble hélice, es decir al pegarse las topoisomerasas van a generar que el DNA se abra, que se forme un pequeño bucle en la región próxima a donde se va a polimerizar el ADN, estas topoisomerasas no se unen de a 1 , se unen 20 o 30 de estas moléculas por cada sección y su función es desestabilizar al DNA para generar pequeños bucles.
Al generar este pequeño espacio, este va a ser aprovechado por las enzimas denominadas DNA girasas, Al igual que las topoisomerasas las DNA girasas se unen varias aprovechando el bucle formado por las topoisomerasas. Las DNA girasas son homopéptidos que tienen dos dominios, en cada dominio estas moléculas tiene como un bolsillo, una entrada donde se va a unir el DNA, entonces por un bolsillo se sujeta una hebra de DNA y por el otro bolsillo se sujeta a la otra. Cada uno de los bolsillos tiene la capacidad de cortar DNA, entonces se hace dos cortes (uno en cada hebra), y a la DNA girasa que tiene enfrente le pasa las dos hebras cruzadas, las une, gira y ya tiene una vuelta menos.
La Iniciación
Es el fenómeno por el cual se da inicio a la síntesis del ADN y la formación de la horquilla de replicación, este fenómeno esta a cargo de un complejo multinezimatico denominado “primosoma”.
Para separar la doble hebra de DNA la principal molécula es la DNA helicasa, su función es abrir esta doble hebra, esta formada por muchas subunidades que se arman en forma de anillo sobre una hebra de DNA y va avanzando deshaciendo puentes de hidrogeno.

Estructura de la DNA helicasa






Una vez que el DNA se ha abierto en dos hebras, hay que asegurar que el DNA se quede en estado de monohebra y no vuelva a unirse. Esto es un problema puesto que el DNA es bastante “pegajoso” y rápidamente podría formar puentes de hidrogeno con la otra cadena que además esta muy cerca, para que esto no ocurra están las proteínas denominadas SSB, proteínas de unión a cadenas de enzimas. Las SSB son proteínas que se van a unir al DNA manteniendo es estado de monohebra, bloqueando la formación de puentes de hidrogeno.
El Mecanismo De Cebado
La DNA polimerasa no hace DNA directamente, necesitan de un PRIMER (secuencias cortas de bases nitrogenadas que reconocen secuencias en el DNA por complementaridad de bases). La función real de una DNA polimerasa es generar enlace fosfodiester, es decir a una base nitrogenada preexistente la DNA polimerasa la va a unir a otra base nitrogenada, si es que no hay una base nitrogenada preformada la DNA polimerasa no va poder formar enlace fosfodiester.

Una vez que el DNA esta desenrrollado y en estado de monohebra estable, recién llega el mecanismo de cebado o la formación del PRIMER para dar lugar al primosoma que va a ser usado como sustrato por la DNA polimerasa para generar enlace fosfodiester.

De ninguna manera la DNA polimerasa puede formar un PRIMER, es ahí que llegan la RNA polimerasas que si pueden formar PRIMERS, entonces este segmento inicial (PRIMER) no es DNA es RNA.
El DNA es reconocido por la una RNA polimerasa denominada también Primasa, entonces la molécula encargada de generar el PRIMER par el inicio de la duplicación es la Primasa, que va a reconocer la una secuencia de ADN y va a formar ARN hasta formar un determinado tamaño, entonces la ARN polimerasa va a ser desplazado por la DNA polimerasa que va a continuar formando enlace fosfodiester.
Síntesis Y Elongación Del DNA
En procariotas las DNA polimerasas son de tres tipos I, II y III y en eucariota hay un numero bastante grande (25 hasta el 2002 y siguen apareciendo mas).
En bacterias la enzima encargada de la replicación de DNA es la DNA polimeras III, mientras que la I esta encargada de los fenómenos de reparación del ADN, y la II también se presume que estaría implicada en estos fenómenos de reparación del DNA aunque se ha visto que en bacterias en las que se ha suprimido la DNA polimerasa II no se ven perjudicadas en ninguna forma, por eso la función de la DNA polimerasa II no esta muy clara.
La DNA polimerasa III es una molécula bastante grande, compuesta por muchas subunidades. Las subunidades que forman enlaces fosfodiester encargadas de la síntesis de DNA son las subunidades alfa, mientras que las demás subunidades son reguladoras.
Ahora, no siempre Adenina se une con Timina, podría unirse con Citocina o con Guanina en lo que denominaríamos un emparejamiento incorrecto (mutación). Deberíamos esperar una tasa de mutación de 10-6, es decir que la DNA polimerasa se equivoque 1 de cada millón de pares de bases. Pero esto no es lo que biológicamente ocurre, sino que este número es menor, en realidad la DNA polimerasa se equivoca con una tasa de mutación 10-8 ó 10-10, es decir un error por cada 100 a 1000 millones de pares de bases. Esto quiere decir que de alguna manera la enzima “se da cuenta” de que ha cometido un error y lo repara.
Sabemos que siempre se debe unir una pirimidina con una purina, dos moléculas de diferente tamaño. Entonces si se unieran dos pirimidinas el DNA se vería como si tuviera una región de estrechez, y si se unieran dos purinas se vería como un bulto, una región de ensanchamiento. Entonces cuando la DNA polimerasa detecta el error retrocede lo deshace y vuelve a avanzar, de esa manera el numero de mutaciones va disminuyendo.
Entonces la DNA polimerasa sintetiza ADN de 5’ a 3’ y escinde el ADN de 3’ a 5’. La DNA polimerasa I, II y III tienen la función de sintetizar ADN pero además la DNA polimerasa tiene la función de reparar ADN.
La estructura de la DNA polimerasa I tiene la forma de una mano cerrada por cuya palma pasa el DNA.
Sabemos que una hebra de DNA es 5’-3’ y su complementaria es 3’-5’, y la DNA polimerasa solo forma DNA en una dirección (5’-3’) entonces el avance de la DNA polimerasa va a coincidir con una de las hebras, que va a ser la cadena líder, pero ¿Qué sucede con la otra hebra?, aquí se va a generar ADN en pequeños fragmentos denominados fragmentos de Okasaki ( también de 5’ a 3’) en lo que denominamos la cadena retrasada. Entonces el DNA se va a formar de manera continua en la cadena líder y se forma a saltos en la cadena retrasada.
Cada fragmento de Okasaki es un replicón y cada uno tiene un ORI y al tenerlo es reconocido por un primosoma y se le va a generar un PRIMER, es decir se la va a generar un pequeño segmento de RNA. Cada fragmento de Okasaki tiene un tamaño de 1000 a 2000 pares de bases.
Cada fragmento de okasaki debe unirse al siguiente para finalizar la replicación, pero ¿Cómo se unen estos dos fragmentos?, es ahí donde entra en acción la DNA polimerasa I que se va a unir a esta región discontinua, va a poner DNA y va sacar el PRIMER (RNA) reemplazándolo con DNA (siempre de 5’ a 3’), y finalmente actúa otra enzima llamada DNA ligasa, que es la encargada de unir estas melladuras de DNA.
Ya he mencionado que si hablamos de DNA polimerasa I, II Y III estamos refiriéndonos a procariotas, en aucariotas la unión de los fragmentos de okasaki esta dada por muchas enzimas (25 enzimas) algunas de las cuales son muy importantes, las denominadas proteínas G.

El Problema De Los Telómeros
Los telómeros se encuentran en las regiones terminales de los cromosomas, son estructuras con una secuencia altamente repetitiva, sirven para proteger a los cromosomas de la autodegradación por la actividad de nucleasas endógenas. Además su longitud esta altamente relacionada al envejecimiento y al cáncer.
Debido a que los DNA de cadena simple son un sustrato para numerosas nucleasas, los telómeros se protegen generando estructuras secundarias “trébol G”.
Debido a la imposibilidad de la acción de la DNA polimerasa III, durante mucho tiempo se sospecho que esta estructura seria sintetizada por un DNA polimerasa diferente. Encontrándose así a la telomerasa, la cual es un Ribozima con actividad de DNA polimerasa, contiene un molde intrínseco de RNA (primer) lo cual explica la gran repetitividad de su secuencia.


Secuenciación Del ADN
Con el fin de obtener grandes cantidades del DNA deseado y de facilitar su secuenciamiento, este debe ser incorporado en un vector (generalmente plasmídico) mediante reacciones de endonucleasas de restricción y ligación.
Con el fin de obtener la secuencia de bases nitrogenada de un fragmento de DNA, se requiere tener a este en un estado de cadena simple.
Además, se necesita de una polimerasa que pueda iniciar la síntesis a partir de un fragmento de hebra simple, tal es el caso de la DNA polimerasa I del fago T4.
Debido a que el fragmento que se desea secuenciar es desconocido se deben diseñar primers dirigidos a las regiones flanqueantes presentes en el vector de clonación. Este primer va marcado radioactivamente.
Se preparan 4 reacciones de PCR diferentes, en donde participaran el PRIMER, los cuatro dideoxinucleotidos (dATP, dCTP, dTTP y dGTP) además de una versión desoxy de cada uno de estos en cada tubo de reacción. Este desoxydesoxy nucleótido, competirá con su homologo normal y al ganar la posición detendrá el crecimiento de la cadena ya que no tiene extremo 3’ OH al que puedan seguir agregándose nucleótidos.
Luego, los productos de PCR serán separados por tamaños, en geles de poliacrilamida, estos serán expuestos a placas autoradiograficas, las que registraran las marcas radioactivas.